基因工程实验报告的实验步骤

实验一:大肠杆菌DH5α和BL21感受态细胞的制备 
【实验步骤】 
1 从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌DH5α单菌落,接种到5mL LB培养基中,37℃振荡培养过夜。 
2 取1mL培养物接种到100mL LB培养基(250mL三角瓶)中,37℃振荡培养2~3h。 3 将菌液转移到50mL离心管(2管)中,冰上放置15min。 4 4℃ 4000 rpm 离心5min,弃去上清液,倒置使培养液流尽。 
5 用20 mL 冷CaCl2溶液悬浮菌体沉淀合并成一管,在4℃ 4000 rpm 离心5min,弃去上清液。 
6 用10 mL 冷CaCl2溶液悬浮菌体沉淀,冰浴30min。 
7  4℃ 4000 rpm 离心5min,弃去上清液,用2 mL的冷CaCl2溶液悬浮。 8 分装到数个EP管中,每管200 uL,冷冻保存备用。 

 

实验二:目的基因质粒(T-SOD或T-IL218) 
和表达载体质粒(PET32或PET30)的转化及大量提取 
【实验步骤】 
一、载体的转化(无菌条件,冰上进行) 1、取200 uL 新鲜制备的感受态细胞,分别加入质粒DNA 2 uL(PET32a,IL-18),混匀,冰上放置30min。 
2、将EP管放到42℃ 保温90s,冰浴 2min。 
3、加入800uL LB液体培养基,37℃慢摇复苏1 h。 
4、将100 uL 的复苏细胞涂布在含有Amp(100mg/mL)的LB培养皿中,正置平皿30min(使菌液被培养基吸收)。 
5、倒置平皿37℃培养16 h,出现菌落。 二、质粒的提取 
1 挑取单菌落接种于100 mL 加入50uL Amp 的LB液体培养基中,振荡培养过夜。 
2 过夜培养的菌液加入1.5 mL的小指管(20个每组)中,每次1 mL,4℃,12000 rpm,离心1min,4次,弃上清。 
3 加入150uL溶液Ⅰ悬浮细胞,漩涡振荡,室温静置10min。 
4 加入350uL溶液Ⅱ(新鲜配制),轻微颠倒混匀20次,冰浴5min。(不能再剧烈震荡) 5 加入300uL溶液Ⅲ(冰上预冷),颠倒混匀20次,不能剧烈震荡,冰浴10min。 6 4℃,12000 rpm,离心10 min,取上清转移至另一离心管中。 7 向上清中加入0.6倍异丙醇,轻轻混匀,室温静置20 min。 
8 4℃,12000 rpm,离心10 min,弃上清,倒扣于吸水纸上,吸净液体。 
9 用1mL 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀2次,每次4℃,12000 rpm,离心3min,吸去上清。 10 55℃烘干至无酒精,加入20uL TE,所有集成一管后加入RNase 1~2uL,37℃消化1~2h,-20℃保存。 
11 电泳分析。制胶:0.14g琼脂糖,20mL 1×TBE缓冲液,溶解后倒入制胶板,放入梳子,冷却凝固待用。点样:6uL质粒+1uL上样缓冲液。电压:180V,电泳至蓝色带距离点样孔3cm

 

实验三 目的基因质粒和表达载体质粒的酶切及其产物的分离纯化 
【实验步骤】

1 酶切

酶切体系 

试剂                       小量酶切                              大量酶切

灭菌水                        5uL                                    —

质粒                         10uL                                  88uL

EcoRⅠ                       0.5uL                                 1uL

HindⅢ                       0.5uL                                 1uL

10×Tango buffer             4uL                                   10uL

终体积                       20uL                                  100uL

按以上酶切体系加入0.5 mL EP管中,37℃放置3h,电泳回收片段。 (点样:酶切体系100uL+上样缓冲液20uL。)

2 酶切产物的回收 
1) 将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分放入干净的离心管中,
称取重量。 
2) 向胶块中加入3倍体积溶胶液(如果凝胶重为0.1g,其体积可视为100uL,则加入300uL
溶胶液),50-55℃水浴放置10min,期间不断温和地上下翻转离心管,以确保胶块充分溶解。 
注意:溶胶时,如果溶胶液变为红色(正常情况下为淡黄色),可向含有DNA的胶溶液中加10-30uL 3N醋酸钠(pH5.2)将溶液调为淡黄色,否则将会影响DNA与吸附柱的结合,影响回收效果。 
3) 将上一步所得的溶液加入一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中),13,000rpm 离心
30-60s,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放入收集管中。 
注意:胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱,因为吸附柱在较高温度时结合DNA的能力较弱。 
4) 向吸附柱中加入700uL漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),13,000rpm 离
心30-60s,倒掉废液,将吸附柱重新放入收集管中。 
5) 向吸附柱中加入500uL漂洗液,13,000rpm 离心30-60s,倒掉废液。 
6) 将离心吸附柱放回收集管中,13,000rpm 离心2min,尽量出去漂洗液,将吸附柱开盖
于室温1-2min,彻底晾干,防止残留的漂洗液影响下一步的实验。 
7) 将吸附柱放到一个干净的离心管中,向吸附膜中间位置悬空滴加适量65-70℃预热的洗
脱液,室温放置2min。13,000rpm 离心2min收集DNA溶液。 8) DNA产物-20℃保存。 
完毕后电泳检测回收与纯化效果:DNA回收纯化后,电泳检测应为单一的一条带,如果切胶过程中不慎带上染带,回收后电泳结果可能会出现两条以上的带,这时应重复上述方法进行回收与纯化。 

 

实验四 目的基因与表达载体的重组及重组子的筛选与鉴定 
【实验步骤】 
1载体与目的基因的连接 
1) 在一1.5mL EP管中加入2uL酶切后的载体DNA与6uL目的DNA片段。 2) 添加1uL的10×buffer以及1uL的T4DNA连接酶,总体积10uL。 3) 16℃水浴条件下保温过夜连接。 2感受态细胞与连接产物的转化 1) 取感受态细胞BL21(实验一制备) 200uL,加入6uL连接产物,轻轻用枪吹打混匀(不
可震荡)。 2) 冰浴30min。 
3) 热激:42℃保温90S,冰浴2min。 
4) 加入800ul  LB培养基,37℃慢慢复苏30min。

5) 将复苏菌液4000r/min离心1min,先吸去800μL上清,再将细胞吹散成细胞悬液,取
50μL细胞悬液直接涂布在含氨苄青霉素(Amp)100ug/ml、X-gal和IPTG的LB选择平板上。 
6) 将平板正向放置30min左右至液体被吸收,倒置平板37℃培养16—20h出现菌落,其
中白色为重组质粒。 
  3 重组子的鉴定(蓝白斑筛选,小提质粒比大小和酶切分析) 
1)将白色单菌落接入3mL 含抗生素(Amp)的LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜。 2)按实验二的方法提取质粒DNA,20uL RTE溶解DNA沉淀。 3)双酶切质粒DNA 20uL 体系,方法同上。 
4)1%琼脂糖凝胶电泳检测重组质粒和它的酶切产物。 
(酶切鉴定重组子可见重组成功的重组子有两个条带:一为切为线性的PET32a质粒条带,一为目的基因条带。) 
实验五 目的基因在大肠杆菌中的诱导表达及表达产物的SDS-PAGE分析 
实验I 、外源基因在大肠杆菌中的诱导表达 
【实验步骤】 
1. 分别挑取白斑菌落(重组菌株)、蓝斑菌落(非重组菌株)于5ml 含AMP的LB液体培养基中,37℃,190r/min振荡培养过夜(注意取菌株要在超静工作台上操作,一定注意无菌)。 2.分别取过夜培养菌1ml接种到5ml含AMP的LB液体培养基中(蓝,白斑各3管,作好标记),于37℃摇床培养4h左右,达到1个OD值。 
3.因为诱导剂IPTG的量,诱导条件,诱导时间,培养基成分都可影响诱导表达,所以可按如下6组设计培养

摇瓶时间(t/h)IPTG/ul温度T/℃ 样液
5732
5737
5742
5732
5737
5742

4.分别取 6支试管按上述表格控制条件,摇瓶培养5h。 
5. 取1ml摇瓶后菌液于离心管,共6支,4℃低温离心,12000 r/min,5 min,收获菌体,弃上清,取沉淀(菌体可放-20℃存放备用)。 
6.向每支试管沉淀均加入200μL TE液,将细胞悬浮。 
7. 每管加入200μL  2 X SDS buffer。开水煮沸5min,再冰浴2min,4℃,12000 r/min,5 min,取上清液做凝胶电泳。

8.观测结果及分析(实验Ⅱ) 

实验Ⅱ  SDS-PAGE检测表达蛋白  

【实验步骤】

1. 配制分离胶

分离胶配方  

双蒸水   分离胶缓冲液       30%胶贮液       10%SDS        TEMED         10%AP 
6.7ML       5ML               8ML          200μL        15μL         150μL   

①按要求装好胶板 ②按比例调好分离胶,混匀后加入两玻璃夹缝中,到上口约2cm处,并小心在胶面上加入 1cm 蒸馏水,约 40 min,等胶自然凝聚后倾斜倒,出蒸馏水,并在两玻璃板夹缝中水平插入 1.5 mm 的梳子(在胶面上加入蒸馏水称水封,其目的是保持胶面平整和防止空气进入,影响凝胶)。  
2.按配方配制好浓缩胶 
浓缩胶配方 双蒸水 
浓缩胶缓冲
液 胶贮液 10%SDS TEMED 10%AP 6.1ML 2.5ML 1.3ML 100μL 15μL 75μL  
混匀后加入到分离胶上,并没过梳子,待凝固后小心拨出梳子。

3.样品制备 
菌体样品与 2×上样缓冲液 l:1 混匀,并在 100C 沸水浴中保温 3-5 min,取出待用。

4.点样,电泳:开始电泳后,先恒压80V,样品进入分离胶后恒压120V,至电泳带跑到前沿后停止电泳。 
5.固定、染色、脱色:电泳完毕,将胶板从电泳槽中取出,小心从玻璃板上取下凝胶,将凝胶浸泡于染色液中染色30min左右,最后加脱色液放到脱色摇床上脱色至区带清晰为止。